Techniques d'études de la cellule
Les techniques d'études de la cellule couvrent la microscopie optique (lumière directe, contraste de phase, fluorescence, FISH) et électronique (MET, MEB, cryofracture), ainsi que les méthodes d'isolement et de culture cellulaire. Ce cours est essentiel pour comprendre comment on observe et manipule les cellules.
Objectifs essentiels
- 1Distinguer les différents types de microscopes et leurs applications
- 2Connaître les étapes de préparation des échantillons
- 3Comprendre le protocole de passage cellulaire
- 4Maîtriser les principes de la fluorescence et de la technique FISH
Microscopie optique ou photonique Utilise un faisceau de lumière et des lentilles grossissantes. Deux variantes principales : - Lumière directe : lumière blanche, coloration nécessaire, cellules mortes ou tissu - Contraste de phase ★★ : condenseur + diaphragme créant des ombres, exploite les changements de phase, permet d'observer cellules vivantes et transparentes
Préparation des échantillons Fixation (alcool ou formol/formaldéhyde), congélation (azote liquide), inclusion en paraffine (précédée déshydratation), coupe tissulaire (microtome), dépôt sur lame + coloration.
Microscopie à fluorescence Principe : lampe UV ou laser excite un fluorochrome. Applications : localiser une protéine, détecter expression protéique. Origines : GFP naturelle, substance fluorescente spécifique, immunofluorescence (anticorps + fluorophore, cellules non vivantes). Microscope confocal à balayage laser : photomultiplicateur + diaphragme, images 2D précises de localisation protéique.
Technique FISH : Séparation des deux brins ADN par la chaleur, hybridation avec une sonde complémentaire → détecter séquences spécifiques ou marquer des chromosomes au microscope à fluorescence.
Microscope électronique Faisceau d'électrons, fixation toujours nécessaire (pas de cellules vivantes), visualise virus. Préparation : congélation ou inclusion + coupe + coloration aux sels métalliques. Cryofracture : congélation azote → fracture couteau sous vide → décapage → vaporisation sels oblique → observation directe surface d'un feuillet membranaire. MET (2D, structure interne), MEB (reconstruction 3D surface).
Isolement et culture cellulaire Isolement : à partir sang (anticoagulant + centrifugation → globules blancs) ou explant (fragments de tissu). Deux types de culture : suspension (cellules non adhérentes, flottent) ou support (cellules adhérentes, fond du flacon). Éléments nécessaires : support (boîte Pétri/flasque), milieu nutritif (gélose bactéries, liquide eucaryotes), conditions stériles (hotte + flamme).
Culture cellules eucaryotes SVF (sérum de veau foetal) : facteurs de croissance. Couleur milieu : rouge pH 7,4, jaune = acidification. Culture primaire : cellules prélevées récemment, division limitée. Lignées cellulaires : immortalisées, division illimitée. Prolifération jusqu'à confluence (cellules normales).
Protocole de passage cellulaire (pour cellules adhérentes) : 1. Retrait milieu → tampon sans Ca²⁺/Mg²⁺ 2. Détachement : trypsine (clive protéines d'adhésion) + EDTA (chélateur Ca²⁺/Mg²⁺, inactive jonctions) 3. Inactivation trypsine : ajout milieu avec SVF → centrifugation, élimination surnageant 4. Culture secondaire : remise en suspension culot dans milieu complet + SVF → répartition nouvelles boîtes
⚠ Pièges fréquents au concours
- •Le contraste de phase N'EST PAS un microscope à fluorescence – il n'utilise pas de fluorochrome
- •Pour la microscopie à fluorescence, la fixation N'EST PAS toujours obligatoire : si GFP, observation sur cellules vivantes possible
- •Pour la microscopie électronique, la fixation EST TOUJOURS nécessaire (pas de cellules vivantes)
- •L'inclusion se fait en RÉSINE (pas en paraffine) pour la microscopie électronique
- •L'immunofluorescence utilise un anticorps couplé à un FLUOROPHORE, pas une enzyme
- •La cryofracture permet d'observer la SURFACE d'un FEUILLET membranaire (pas la structure interne)
- •Ce sont les GLOBULES BLANCS (pas hématies) qui sont récupérés par centrifugation du sang
- •Les cultures secondaires sont possibles avec des cellules NORMALES (pas uniquement cancéreuses)
- •La cytométrie en flux sépare des CELLULES (pas des organites)
- •La technique FISH s'observe au microscope à FLUORESCENCE, pas électronique
Liens inter-chapitres
- La cellule : Généralités — Les types cellulaires (procaryotes, eucaryotes, virus) définissent le choix du microscope adapté
- La membrane plasmique — La cryofracture révèle les feuillets membranaires ; la fluorescence localise les protéines membranaires