Techniques d'étude de la génétique

La PCR (Polymerase Chain Reaction)

### Principe La PCR amplifie exponentiellement un fragment d'ADN cible en utilisant : - Une ADN polymérase thermostable (Taq polymérase, de Thermus aquaticus) - Deux amorces (primers) encadrant la région à amplifier (séquences courtes ~20 nt complémentaires de chaque brin) - Les 4 dNTP (désoxyribonucléotides)

### Les 3 étapes d'un cycle PCR

1. Dénaturation : 94-95°C pendant 30 s → séparation des 2 brins d'ADN 2. Hybridation (anneling) : 50-65°C pendant 30 s → les amorces se fixent sur leurs séquences complémentaires (Tm des amorces) 3. Élongation : 72°C pendant 1 min → la Taq polymérase synthétise le nouveau brin en 5'→3'

Amplification : 30-40 cycles → 2ⁿ copies (n = nombre de cycles) → amplification de l'ordre du million de copies

Visualisation : gel d'agarose + bromure d'éthidium (ou SyBr Green) → bandes fluorescentes sous UV

### Variantes de la PCR

RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) : - Analyse de l'ARNm → transcrire l'ARNm en ADNc (ADN complémentaire) par la transcriptase inverse → PCR classique sur l'ADNc - Utile pour les transcrits (sans les introns)

PCR quantitative (qPCR / RT-qPCR) : - Mesure la quantité d'ADN/ARN en temps réel par fluorescence - SYBR Green (fluorescent, non spécifique) ou sonde TaqMan (sonde fluorescente spécifique) - Applications : quantification virale (charge virale VIH), diagnostic COVID-19, expression génique

PCR multiplexe : plusieurs paires d'amorces → amplification simultanée de plusieurs fragments

Séquençage de l'ADN

### Méthode de Sanger (séquençage par terminaison de chaîne)

Principe : - Synthèse d'ADN avec des ddNTP (didésoxyribonucléotides) fluorescents → terminaison aléatoire - Capillaire → électrophorèse → fragments séparés par taille → fluorescence - Lecture : séquence de quelques centaines à ~1 000 pb

Indications : vérification d'une mutation précise, clonage, séquençage ciblé

### NGS (Next Generation Sequencing, séquençage haut-débit)

Principe : - Fragmentation aléatoire du génome → ajout d'adaptateurs → amplification sur puce → séquençage en parallèle de millions de fragments - Alignement bioinformatique sur un génome de référence

Applications : - WGS (Whole Genome Sequencing) : séquençage du génome entier (3 Gb) - WES (Whole Exome Sequencing) : séquençage des seuls exons (~1 % du génome) - Panels de gènes ciblés : maladies héréditaires, oncologie - Métagénomique : identification de micro-organismes

Avantages : détection simultanée de nombreuses mutations, grandes régions, à coût décroissant

Analyse chromosomique

### Caryotype

Définition : visualisation microscopique de l'ensemble des chromosomes d'une cellule en métaphase (chromosomes les plus condensés)

Technique : 1. Prélèvement de cellules (sang, tissu fœtal) 2. Culture cellulaire + colchicine (bloque la mitose en métaphase) 3. Choc hypotonique + fixation 4. Étalement sur lame → coloration (Giemsa → bandes G) 5. Analyse en microscopie

Résolution : détecte les anomalies >5-10 Mb (grandes délétions/duplications, translocation, aneuploïdie)

Indications : anomalies chromosomiques suspectées (T21, Turner, Klinefelter), fausse couche à répétition, infertilité

### FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)

Principe : - Sonde fluorescente complémentaire d'une séquence chromosomique d'intérêt - Hybridation directement sur les chromosomes - Visualisation par microscopie à fluorescence

Avantages vs caryotype : - Détecte des microdélétions/microduplications (<5 Mb, invisibles au caryotype) - Applicable en interfase (cellules non en division) - Plus rapide que le caryotype

Applications : syndrome de DiGeorge (délétion 22q11), diagnostic de translocation Philadelphia (LMC)

### Array-CGH (Comparative Genomic Hybridization)

- Hybridation simultanée de l'ADN du patient et d'un ADN de référence sur une puce à ADN - Détecte des variations du nombre de copies (CNV) à très haute résolution - Remplace le caryotype dans de nombreuses indications (anomalies congénitales inexpliquées)

Les techniques de buvardage (blotting)

### Southern Blot (ADN) - Analyse de l'ADN → digestion par enzymes de restriction → électrophorèse → hybridation avec sonde spécifique - Détecte des mutations, délétions, expansions de triplets - Dérivé du nom de son inventeur Edwin Southern (1975)

### Northern Blot (ARN) - Analyse de l'ARNm → électrophorèse → hybridation avec sonde - Mesure l'expression d'un gène (quantité et taille du transcrit) - Moins utilisé depuis le développement de la RT-qPCR

### Western Blot (protéines) - Analyse de protéines → SDS-PAGE (séparation par taille) → transfert sur membrane → anticorps primaire + secondaire (détection) - Confirme la présence et la taille d'une protéine - Exemple classique : confirmation du VIH (Western blot après ELISA positif)

Mémo : Southern = ADN | Northern = ARN | Western = Protéines

Diagnostic anténatal

### Techniques de prélèvement

Amniocentèse : - Prélèvement de liquide amniotique (cellules fœtales desquamées) - Timing : 15-18 SA ± (après 14 SA) - Risque de fausse couche : ~0,5 % - Indications : risque chromosomique élevé (T21), signe échographique

Biopsie de trophoblaste (villositées choriales, BVC) : - Prélèvement de villosités choriales (tissu placentaire) - Timing : 11-13 SA (plus précoce que l'amniocentèse) - Risque de fausse couche : ~1 % - Avantage : résultat plus précoce

### Tests non invasifs de screening

T21 au 1er trimestre : - Clarté nucale (échographie 11-13 SA) + marqueurs biochimiques sériques maternels (PAPP-A, β-hCG) - Dépistage (pas diagnostic) → calcul d'un score de risque

DPNI (Dépistage Prénatal Non Invasif) ou cfDNA (cell-free DNA) : - Analyse d'ADN fœtal circulant dans le sang maternel (prise de sang maternelle) - À partir de 10 SA - Détecte T21, T18, T13, anomalies des gonosomes - Sensibilité > 99 % pour T21 → mais reste un dépistage (pas un diagnostic, confirmation par caryotype)