Méthodes et techniques en histologie
Avant toute analyse microscopique, un tissu prélevé passe par neuf étapes successives : fixation, déshydratation-imprégnation, inclusion en paraffine, microtomie, déparaffinage, réhydratation, coloration, déshydratation et montage. Connaître les pouvoirs de résolution des différents microscopes (optique 0,2 µm, électronique à transmission 0,08 nm) et les résultats des deux colorants de référence — hématéine-éosine et trichrome de Masson-Goldner — est indispensable pour réussir les QCM de méthodes histologiques.
Objectifs essentiels
- 1Citer et ordonner les neuf étapes de préparation d'un tissu pour la microscopie optique en précisant l'objectif de chacune
- 2Comparer les différents types de microscopes selon leur pouvoir de résolution et les structures qu'ils permettent d'observer
- 3Distinguer les disciplines apparentées à l'histologie : cytologie, anatomopathologie, histologie fonctionnelle
- 4Identifier les agents de fixation utilisés selon le type de microscopie : formol en microscopie optique, glutaraldéhyde en microscopie électronique
- 5Déduire les résultats de coloration de l'hématéine-éosine et du trichrome de Masson-Goldner par type de structure tissulaire
Les disciplines liées à l'histologie
L'histologie est qualifiée d'« anatomie microscopique ». Elle se distingue des disciplines voisines par son objet d'étude : les tissus sains. La cytologie étudie la structure et les fonctions des cellules individuelles. L'anatomopathologie analyse les tissus pathologiques. L'histologie fonctionnelle est plus intégrative : elle croise l'histologie des organes, la physiologie, la biologie cellulaire et la biochimie.
L'histoire de la discipline débute au XVIIe siècle, avec le Dr Malpighi, peu après l'invention du microscope. C'est au XVIIIe siècle que le Dr Bichat forge le concept « anatomofonctionnel du système tissulaire », en associant structure, fonction et pathologie tissulaire à partir d'autopsies et d'expériences de physiologie. L'établissement définitif de l'histologie moderne a nécessité plusieurs siècles supplémentaires grâce aux progrès technologiques.
Les outils d'observation
Le choix de l'outil dépend directement de ce qu'on cherche à voir. Le pouvoir de résolution — distance minimale permettant de percevoir deux points comme distincts — est le paramètre décisif.
L'œil nu résout environ 100 µm, ce qui permet uniquement l'observation macroscopique du prélèvement avant sa préparation.
Le microscope optique atteint 0,2 µm, autorisant l'observation des cellules et des bactéries.
Le microscope électronique à transmission (MET) pousse la résolution à 0,08 nm, soit environ 2 500 fois mieux que le microscope optique. Il permet d'observer les virus, l'ultrastructure cellulaire et les agrégats de protéines. Sa contrainte est la nécessité de travailler sur des coupes extrêmement minces.
Le microscope électronique à balayage est dédié à l'analyse des surfaces : il produit des images en relief mais ne permet pas d'étudier la structure interne des tissus.
Le microscope à lumière polarisée met en évidence les substances cristallines ou semi-cristallines (exemple : le tissu osseux) grâce aux différences de réfringence qu'elles génèrent.
Les neuf étapes de préparation d'un tissu en microscopie optique
L'objectif général est triple : maintenir les tissus dans un état aussi proche que possible de leur état naturel, obtenir des coupes assez fines pour être traversées par la lumière, et révéler les structures par des colorants contrastants.
Étape 1 — Fixation. Le prélèvement est immédiatement immergé dans un liquide fixateur. En microscopie optique, l'agent de référence est le formol (formaldéhyde) ou ses dérivés comme la formaline. Pour la microscopie électronique, on utilise le glutaraldéhyde. La fixation bloque la dégradation, prévient la putréfaction et l'autolyse, durcit le matériel et détruit les pathogènes. Le prélèvement est placé dans des cassettes d'histologie. La durée varie selon la taille de l'échantillon.
Étape 2 — Déshydratation et imprégnation. Des bains d'éthanol de concentrations croissantes (70 à 100 %) éliminent l'eau tissulaire. Une clarification avec des solvants hydrophobes — xylène ou toluène, s'évaporant vers 60°C — rend les prélèvements transparents. L'imprégnation par bain de paraffine liquide à environ 60°C est ensuite réalisée à l'aide d'un automate fonctionnant sous vide.
Étape 3 — Enrobage (inclusion). Le prélèvement imprégné est déposé dans un moule rempli de paraffine chaude liquide à 58°C. Après refroidissement, la paraffine forme un bloc solide. L'objectif est de durcir le tissu pour faciliter la coupe.
Étape 4 — Microtomie. Un microtome tranche le bloc en coupes fines et régulières de 2 à 10 µm. Il est doté d'un système d'avance mécanique, d'un couteau et d'un garde-sécurité. Les coupes sont collées sur des lames de verre avec une solution eau-albumine, étalées sur une plaque chauffante puis séchées.
Étape 5 — Déparaffinage. La paraffine est dissoute dans un bain de toluène ou xylène.
Étape 6 — Réhydratation. Des bains d'éthanol de concentrations décroissantes (100 % vers 70 %) puis d'eau distillée réhydratent le tissu. Ce passage est indispensable car les colorants sont en solution aqueuse.
Étape 7 — Coloration. Les colorants augmentent le contraste des différents composants cellulaires pour les rendre identifiables.
Étape 8 — Déshydratation. Bains d'éthanol de concentrations croissantes.
Étape 9 — Montage. La lame passe dans du xylène, puis les coupes sont montées entre lame et lamelle dans un liquide de montage à base de toluène qui durcit après séchage.
Les deux colorants de référence
L'hématéine-éosine (HE) est la coloration de loin la plus utilisée en histologie de routine. Elle colore les noyaux en violet et les cytoplasmes en rose.
Le trichrome de Masson-Goldner utilise trois colorants successifs avec rinçages intermédiaires à l'eau distillée. L'hématoxyline colore les noyaux en brun. La fuchsine acide colore les cytoplasmes en rouge et les tissus non conjonctifs. Les fibres de collagène sont colorées en vert par le vert lumière ou en bleu par le bleu d'aniline selon la variante du protocole.
Observation finale
La préparation peut être examinée directement au microscope photonique ou numérisée par un scanner de lame. Ce dernier reconstitue l'ensemble de la préparation et permet de zoomer librement dans n'importe quelle zone du tissu.
⚠ Pièges fréquents au concours
- •Confondre la résolution du microscope optique (0,2 µm) avec celle du MET (0,08 nm) : l'unité change (µm vs nm) et le gain est d'environ 2 500 fois. Les virus ne sont visibles QU'au MET, pas au microscope optique.
- •Le glutaraldéhyde est réservé à la microscopie électronique, pas à la microscopie optique où c'est le formol (formaldéhyde) qui est l'agent de référence. Inverser les deux est un piège classique.
- •Dans le trichrome de Masson-Goldner, l'hématoxyline colore les noyaux en BRUN (pas en violet). La couleur violette des noyaux est propre à l'hématéine-éosine.
- •La température d'inclusion en paraffine est de 58°C (valeur précise à retenir). Ne pas confondre avec les ~60°C du bain d'imprégnation paraffine lors de la déshydratation.
- •La déshydratation précède l'inclusion (éthanol croissant pour éliminer l'eau), et une deuxième déshydratation intervient APRÈS la coloration (étape 8) avant le montage. Ne pas inverser ces deux déshydratations.
- •Lors de la réhydratation (étape 6), la concentration en éthanol est décroissante (100% → 70%) — logique inverse de la déshydratation initiale (étape 2 : 70% → 100%). La direction des bains indique l'objectif.
- •Le microscope à balayage étudie les surfaces et produit des images en relief : il ne sert pas à analyser l'ultrastructure interne des cellules, contrairement au MET.
- •Les fibres de collagène peuvent être colorées en VERT (vert lumière) OU en BLEU (bleu d'aniline) selon la variante du trichrome de Masson utilisée — les deux réponses sont correctes. La fuchsine acide ne colore pas le collagène.
Liens inter-chapitres
- Les épithéliums de revêtement — La coloration HE est la technique standard pour observer les épithéliums : les noyaux basaux violets et les cytoplasmes roses sont les repères visuels directs utilisés pour identifier les assises cellulaires et les types épithéliaux.
- Les épithéliums glandulaires — Le trichrome de Masson-Goldner est particulièrement utile pour distinguer les glandes exocrines (cytoplasmes rouges) du tissu conjonctif environnant (collagène vert ou bleu), une compétence directement applicable à ce chapitre.